Investigation about the mode of action of radulanin A, a natural phytotoxic compound
Étude du mode d’action de la radulanine A, une molécule phytotoxique d’origine naturelle
Résumé
Radulanin A is a natural substance identified in the 1970s in liverworts of the Radula genus, and recently shown to have phytotoxic activity. The purpose of this PhD project was to determine the mode of action of this substance, using Arabidopsis thaliana as a model plant. The development of a 5-step total synthesis route made it possible to synthesize radulanine A and structural analogues in sufficient quantity to carry out biological studies. This new synthetic route employs a final cycle-extension step by flow photochemistry starting from a chromene designated "Radula chromene" in the manuscript. This compound, as well as the other intermediates of this synthetic route, are natural molecules also found in liverworts of the Radula genus. Of these analogues, Radula chromene and tylimanthin B exhibit phytotoxicity similar to that of radulanin A. In contrast, the O-methylated analog of Radula chromene appeared biologically inactive, suggesting that the phenolic group is essential for the phytotoxic activity of the studied compounds. The study of the phytotoxicity of the analogues thus provided the first evidence linking the structure and phytotoxic activity of radulanine A and its natural analogues. The impact of these different molecules on the photosynthetic electron transfer chain was studied in detail using chlorophyll fluorescence analyses. The data obtained indicate that the bioactive analogues inhibit the performance of the photosynthetic electron transfer chain in treated seedlings. Thermoluminescence analyses carried out on isolated photosystems II indicate that radulanin A and Radula chromene, but not the O-methylated chromene analog, inhibit the activity of the QB site of photosystem II. This study therefore establishes a strong correlation between inhibition of the photochemical phase of photosynthesis and phytotoxicity of radulanine A and its bioactive analogues. Radulanin A is thus the first molecule with a dihydrooxepin structure to be identified as an inhibitor of this site. In parallel, the effect of Radula chromene on the metabolism of Arabidopsis seedlings was studied using a GC-MS metabolomics approach. The ninety-eight metabolites detected and quantified in the seedlings during this study were mainly derived from primary metabolism (sugars, amino acids, organic acids, purines). Eighty-two metabolites showed a significant difference in abundance after treatment with Radula chromene. Variations are fast, and mainly observed in response to the highest dose (400 µM) applied. The application of Radula chromene induced a reduction in the quantity of most of the metabolites detected, suggesting an impact on the overall primary metabolism of the seedlings. Preliminary experiments were carried out to establish a functional link between the effect of Radula chromene on metabolism and its phytotoxicity. Overall, the development of a new short total synthesis of radulanin A defined the potential for inhibition of photosynthesis by radulanin A and certain structural analogues. Further studies identified radulanine A and Radula chromene as photosystem II inhibitors within the QB site. Investigation of the impact of Radula chromene on the seedling primary metabolome suggests that inhibition of photosynthesis may not be the only mode of action responsible for phytotoxicity. Complementary analyses to the metabolomic study, such as a lipidomic study, would enable this hypothesis to be verified.
La radulanine A est une substance naturelle identifiée dans les années 1970 chez des hépatiques du genre Radula et dont l’activité phytotoxique a été récemment mise en évidence. L’objectif de la thèse a été de déterminer le mode d’action de cette substance en utilisant Arabidopsis thaliana comme plante modèle. La mise au point d’une voie de synthèse totale en 5 étapes a permis de synthétiser la radulanine A ainsi que des analogues structuraux en quantité suffisante pour réaliser l’étude biologique. Cette nouvelle voie de synthèse utilise une étape finale d’extension de cycle par photochimie en flux à partir d’un chromène désigné « Radula chromène » dans le manuscrit. Ce composé, ainsi que les autres intermédiaires de cette voie de synthèse, sont des molécules naturelles également présentes chez des hépatiques du genre Radula. Parmi ces analogues, le Radula chromène et la tylimanthine B présentent une phytotoxicité similaire à celle de la radulanine A. En revanche, l’analogue O-méthylé du Radula chromène apparait biologiquement inactif, suggérant que le groupement phénolique est indispensable à l’activité phytotoxique des composés étudiés. L’étude de la phytotoxicité des analogues a ainsi permis d’apporter les premiers éléments reliant structure et activité phytotoxique de la radulanine A et de ses analogues naturels. L’impact de ces différentes molécules sur le fonctionnement de la chaîne de transfert d'électron photosynthétique a été finement étudié via des analyses de fluorescence des chlorophylles. Les données obtenues indiquent que les analogues bioactifs inhibent le rendement de la chaîne de transfert d’électron photosynthétique au sein des plantules traités. Les analyses de thermoluminescence menées sur des photosystèmes II isolés indiquent que la radulanine A et le Radula chromène, mais pas l’analogue chromène O-méthylé, inhibent la fonctionnalité du site QB du photosystème II. Cette étude établit donc une corrélation forte entre inhibition de la phase photochimique de la photosynthèse et phytotoxicité de la Radulanine A et de ses analogues bioactifs. La Radulanine A est ainsi la première molécule à structure dihydrooxépine identifiée comme inhibitrice de ce site. En parallèle, l’effet du Radula chromène sur le métabolisme de plantules d’Arabidopsis a été étudié via une approche métabolomique par GC-MS. Les quatre-vingt-dix-huit métabolites détectés et quantifiés dans les plantules au cours de cette étude sont majoritairement issus du métabolisme primaire (sucres, acides aminés, acides organiques, purines). Quatre-vingt-deux métabolites présentent une différence significative d’abondance après traitement par le Radula chromène. Les variations sont rapides, et essentiellement observées en réponse à la plus forte dose (400 µM) appliquée. L’application du Radula chromène induit une réduction de la quantité de la plupart des métabolites détectés, suggérant un impact sur la globalité du métabolisme primaire des plantules. Des expériences préliminaires ont été réalisées pour établir un lien fonctionnel entre l’effet du Radula chromène sur le métabolisme et sa phytotoxicité. Dans l'ensemble, l’élaboration d’une nouvelle synthèse totale courte de la radulanine A a permis de définir le potentiel d’inhibition de la photosynthèse par la radulanine A et certains analogues structuraux. Des études supplémentaires ont permis d’identifier la radulanine A, ainsi que le Radula chromène, comme inhibiteurs du photosystème II au sein du site QB. L’étude de l’impact du Radula chromène sur le métabolome primaire des plantules suggère que l’inhibition de la photosynthèse ne serait pas le seul mode d’action responsable de la phytotoxicité. Des analyses complémentaires à l’étude métabolomique telle qu’une étude lipidomique permettrait la vérification de cette hypothèse.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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